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PCR.qPCR.dPCR.RTPCR.RTqPCR分不清?

发布时间:2024-10-11 21:37:44  来源:医学科研动物平台——现货各月龄自然衰老小鼠模型购买C57老龄鼠价格老龄小鼠购买C57老年鼠价格老年小鼠价格老年小鼠购买价格优惠,现货老龄大鼠老年大鼠购买价格优惠apoe小鼠购买价格,dbdb小鼠购买3  浏览:   【】【】【
PCR、qPCR、dPCR、RT – PCR、RT-qPCR、Real-Time PCR;傻傻分不清?
自从PCR技术被浪出来:PCR传奇史:“浪”出来的生物技术,经历了飞速的发展和技术更新,新冠的洗礼,让所有人都了解到了“核酸检测”的技术。

然而,对于初学者来说,PCR技术的名称和原理往往令人感到困惑,傻傻分不清。某个小伙伴尝试给让你搞懂PCR、qPCR、dPCR、RT - PCR 、RT-qPCR、Real-Time PCR之间的区别和联系。

如果你已经完全分清了,建议继续:多重PCR——病原体检测体系设计原则


1. 普通PCR(就是只做核酸的扩增哦!!!)

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR),即一代PCR,是1985年由美国PE-Cetus公司的科学家Kary Banks Mulis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。其原理类似于DNA的天然复制过程,在体外条件下以指数级速度扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行定性分析。PCR由变性(Denaturation)、退火(Annealing)和延伸(Extension)三个基本反应步骤构成:

①变性:通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂,双链分开而成为单链。这一步骤通常在94℃至95℃的高温下进行,持续30秒至1分钟,确保双链DNA完全解离。


②退火(复性):当温度降低时,引物与模板DNA中互补的区域结合成杂交分子。退火温度通常低于引物本身的变性温度,一般在50℃至65℃之间,持续30秒至1分钟,确保引物与模板DNA特异性结合。;


③延伸(Extension):在DNA聚合酶、dNTPs(四种脱氧核糖核苷三磷酸)和Mg2+等存在下,DNA聚合酶催化引物按照5′→3′方向延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链。延伸温度通常在70℃至75℃之间,持续时间根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度而定。




图1  PCR的基本反应原理


如果想用于核酸的检测,其实还需要进行凝胶电泳的辅助。所以很多人认为的第一代PCR,其实更应该像是凝胶电泳技术,而不是PCR技术本身!!!


经过演化和革新,PCR技术已经发展了三代:普通PCR技术(PCR+凝胶电泳)、实时荧光定量PCR技术(qPCR)以及数字PCR(dPCR)技术。


第一代PCR主要缺点:容易发生非特异性扩增和假阳性结果;检测耗时长,操作繁琐;


只能做定性检测。目前,在临床检测中普通PCR已经成为测序等检测技术的前处理方法,没有太多的独立应用空间。在食品药品等检测和分型中,还是不少国家标准的检测技术(毕竟标准的变革不宜那么频繁!!!要加把劲了,跟上新技术。)


2.实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)


实时荧光定量PCR,也叫Real-Time PCR,即二代PCR,是指在PCR扩增反应体系中加入荧光染料或者荧光基团,在整个PCR过程中通过收集荧光信号实时监测每一个循环中扩增产物量的变化,最后通过标准曲线和CT值对待测样品进行定量分析。qPCR常用的有两种方法:SYBR Green法和TaqMan探针法。


①荧光染料法(SYBR Green):SYBR Green Ⅰ是荧光定量PCR中最常用的荧光染料,它能与所有的双链DNA结合。在PCR反应体系中,加入SYBR Green Ⅰ,它就会在过程中与双链DNA结合,从而产生荧光信号。因此,反应中发出的全部荧光信号就会与反应中双链DNA的量呈正比,荧光强度也会随着产物的增加而增加。但是由于染料与双链DNA是非特异性结合,如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生,也将同时被检测,从而可能导致检测结果不准确,因此可能产生假阳性的结果。


优点:价格相对较低;使用方便;检测灵敏度高。


缺点:检测特异性较低,可能产生假阳性结果;无法进行多重PCR检测。




图2 荧光染料法的工作原理


②荧光探针法(TaqMan技术):TaqMan探针是最早用于定量的方法,也是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时,加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸,5'端标记一个荧光报告基团(Reporter, R),3'端标记一个淬灭基团(Quencher, Q)。当探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,以至于无法检测到荧光信号;而当PCR扩增时(在延伸阶段),探针会被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解,使报告基团和淬灭基团分离,报告基团发射底的荧光不会再被吸收,从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一条DNA,就形成一个荧光分子,PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步,PCR产物越多,荧光信号累积的越多,荧光强度越大。


优点:检测特异性强;灵敏度高;适合进行多重qPCR检测。


缺点:需要根据不同的模板序列,合成不同的探针;靶序列浓度极低或存在大量非特异性扩增时,无法准确定量。




图3 荧光探针法的工作原理




3. 逆转录PCR( Reverse T ranscription - PCR , RT - PCR)


逆转录PCR也叫反转录PCR,将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增相结合,是PCR的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中首先经反转录酶将一条单链RNA逆转录成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。RT-PCR技术灵敏且应用广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。一般通过一步法或两步法进行,一步法是RT反应和PCR反应在同一试管中进行;而在两步法中两个反应是分开依次进行的。


4.实时荧光定量逆转录PCR(Real-time RT-PCR, RT-qPCR)


Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的组合,其中的“RT”是Reverse transcription(逆转录)的意思,所以RT-qPCR就是结合了荧光定量技术的逆转录PCR,即以mRNA或总RNA为模板,先反转录得到cDNA,再以cDNA为模板,通过荧光定量PCR进行定量检测分析。因为RT-PCR只可以定性,但不能进行定量分析。与RT-PCR一样,RT-qPCR定量分析RNA也有两种方法:一步法和两步法。两种方法都需要先将RNA反转录为cDNA,然后再将其作为qPCR扩增的模板,只是一步法中的RT和qPCR在同一试管中进行,两步法中的RT和qPCR是按顺序分开进行。


5.数字PCR(Digital PCR, Dig-PCR, dPCR)


数字PCR被称为第三代PCR技术,它是一种核酸分子绝对定量(直接定量更准确一些!!)技术。相较于qPCR,数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量,可针对核酸分子做更精确的定量分析。其创新之处在于, PCR反应体系经过微滴制备可将目标分子DNA或RNA样品分割至数千到数万个独立的反应单元中,然后对众多微反应单元内的靶序列进行单分子模板 PCR 扩增,实现”单分子模板PCR扩增”。扩增结束后含有目标分子模板的单元会发出荧光信号,最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例,分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。目前的数字PCR技术在病原体筛查、NIPT检测、肿瘤突变检测等方向已得到广泛应用。


相较于第一代普通PCR和第二代qPCR,数字PCR具有以下优势:


优点:无需标准曲线即可对目标分子进行绝对(凡事无绝对,直接更准确)定量;测试结果可直接给出样本具体的浓度/拷贝数,而非CT值;(抑制剂)耐受性强,通过把模板分散到各个反应微单元,能够有效降低抑制剂对扩增的影响,可以实现单分子PCR扩增,非常利于复杂样本和突变样本的检测,具有比传统荧光定量 PCR 更加出色的灵敏度和精确性;可通过荧光编解码实现多重/超多重PCR检测。有个超多重数字PCR培训班干货满满,可以去蹭课哦!链接:超多重数字PCR 黄埔军校


缺点:需要根据不同的模板序列,合成不同的探针;成本相对较高。


图4 dPCR的工作原理


综上所述,PCR技术被浪出来之后,经历了凝胶电泳技术,实时荧光定量PCR(qPCR)技术和数字PCR(dPCR)技术,其中实时荧光定量PCR技术已经发展相对成熟,数字PCR技术还在不断地发展中。当然,除了上述名词之外,还有不对称PCR,Touchdown PCR,ARMS PCR,巢氏PCR等诸多概念,想要了解地更清楚,不想做幕后的小白一样傻傻的分不清,还需要不断地学习才行。古德拜!

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