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【病理超大组织固定大蜡块包埋切片HE染色实验外包服务】

发布时间:2023-07-28 07:20:09  来源:病理超大组织固定大蜡块包埋切片HE染色实验外包服务-至善医学研究院  浏览:   【】【】【


病理超大组织固定大蜡块包埋切片HE染色实验外包服务服务流程

切取新鲜组织经过固定取材脱水透明浸蜡后用特定的包埋模具将前期处理的组织块与融化的石蜡一起包埋成组织蜡块的过程称为组织取材包埋。

超大组织固定超大蜡块包埋实验流程:

取材-脱水-透明-浸蜡-包埋

超大组织固定超大蜡块包埋送样运输要求:

固定组织常温运输保存

制作石蜡切片,切片前须将石蜡渗透组织包埋于石蜡中,而水与石蜡又是不相混合的,所以在浸蜡,包埋前必须将组织内所含的水分脱去。而大多数的组织固定剂是水溶液,随后的水冲洗也使其含有大量水分,因此必须先行脱水,一般是浸入逐级增加浓度的酒精来完成。由于酒精和石蜡不能混合,须再用一种石蜡的溶剂来置换酒精,因大多数石蜡溶剂有使组织的折光率增高并表现为透明或半透明状,所以此步骤又称透明。最后用石蜡浸渍组织并铸制成坚实的蜡块。

常规的石蜡包埋过程包括五个基本步骤,即固定,脱水,透明,浸蜡和包埋。

(一)固定

采取的病理材料必须立即放入10%福尔马林固定液中。

(二)脱水

组织经固定后,尚含有多量水分,而水与透明剂苯、石蜡根本不相融合。必须先把组织中的水分除去。但脱水剂必须是与水在任何比率下均能混合的液体,脱水剂常兼有硬化组织的作用。最常用的脱水剂为酒精、丙酮等。

1.酒精 沸点78.4℃,为最常用的脱水剂。脱水能力强,并能使组织硬化,能较好地与二甲苯透明剂相混合。最终结果表明,只要脱水环节处理好,都会得到好的切片。脱水的程序为70%一80%一95%一100%。各级酒精2—4小时,视材料的大小、厚薄而定。100%酒精有硬化组织的作用,时间不宜太长,一般不超过3小时。脑组织、脂肪组织或疏松结缔组织,脱水时间要适当延长。

2.丙酮 沸点为56℃。脱水作用比乙醇强,但对组织块的收缩较大,主要用于快速脱水或固定兼脱水。脱水时间l一3小时左右。

(三)透明

透明对组织有脱酒精及透明两种作用。当组织中全部为透明剂占有时,

光线可以透过,组织可呈现不同程度的透明状态,此种现象称为透明,具有这种作用的试剂称为透明剂。常用的透明剂有:

1.二甲苯 是最常用的良好透明剂,不影响各种染色。二甲苯易溶于酒精,能溶解石蜡,也是封固剂,不吸收水,透明能力强,易使组织收缩、变脆,故组织块在二甲苯中不宜久留,特别对小动物组织材料必须严格控制好(各种器官的透明差异很大),通常为半小时到1小时左右。

当二甲苯透明时必须持组织放在专用二甲苯皿器中,这样可减少透明时间,有利于组织透明彻底,在换组织块透明时候,所用的镊子等器具必须干燥,不得将水滴混入二甲苯中,因水滴易被组织吸收而影响透明程度,潮湿天气更应引起注意。

2.冬青油(水杨酸甲酯)为无色油样液体,易溶于醇、醚及冰醋酸,难溶于水。透明速度较慢,数小时或数天。一般经无水乙醇脱水后再入冬青油。

(四)浸蜡(透蜡)

组织经脱水透明后要用石蜡等支持剂透入内部,并除去组织中的透明剂,把软组织变为适当硬度的蜡块,以便切成切片。

浸蜡的要点有二:①石蜡要完全渗入细胞的每个部分:②石蜡要紧密而均匀的贴在细胞内外两面,使组织与石蜡成为不可分离的状态。

为了减少组织的收缩和提高浸蜡的效果,浸蜡用的石蜡依据熔点不同,先经低熔点石蜡再经高熔点石蜡。一般设置熔点50—52℃为第一缸蜡,52—54℃为第二缸蜡;54—56℃为第三缸蜡,第三缸石蜡的熔点根据季节可进行调节,夏天使用熔点56—58℃或58—60℃石蜡,盛夏使用熔点60—62℃石蜡。

浸蜡的时间 根据不同组织类型及其大小而定:组织1—2cm大小,浸蜡2—3小时,2—3cm浸蜡3—5小时,对细胞密集,纤维成分少,如肝、肾应减少时间,含脂肪和纤维成分较多的组织需增加时间。

浸蜡时石蜡在温箱内的温度应与石蜡的熔点相配合,温度不可过高过低,过高会使组织高度收缩变脆,无法切片,过低石蜡将凝固达不到浸蜡的作用。常规的作法是调节至略高于石蜡熔点2—3℃。控制温度是浸蜡极其重要的关键。

(五)包埋

将液态的石蜡倒入金属包埋框或包埋的纸盒中,再将浸好蜡的组织块平放底部,注意切面方向朝下放置,待石蜡凝固后去掉包埋框,完全冷却变硬后再修整蜡块,要求组织外围的石蜡保留适中以便切片。

(六)切片前的准备工作

1.修整蜡块 石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介。应先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去,四周留约2mm的石蜡边。留得过少,使连续切片分片困难且易破坏组织;留得过多,徒占地方,同时使标本之间的距离过远而镜检不便。蜡块两边必须切成平行的直线,否则切下的蜡条弯曲,也不可修成圆角,致蜡带容易分开不能成条。

2.玻片处理 一般玻片用76X26mm载片,厚度l一1.5mm,厚于1.5mm的玻片不宜用于高倍镜及油镜的观察,选购玻片应注意:从侧面看白色的为优品,带蓝或绿色的为劣品,平面光滑不带波纹者为上品,稍有波纹者为次品,边缘光滑己加工磨边者为上品,边缘粗糙未经磨边者为次品。载玻片上面如有云雾斑点,系受霉菌侵蚀不能使用。

新的玻片也必须擦洗干净,否则染色时引起切片脱落,方法有①煮沸洗涤法、②洗液浸泡法。最后经95%酒精浸泡脱脂、烘干。

将洗净的载玻片上均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油(防止组织脱片),放置冰箱备用。

(七)切片制作过程

1.将预冷的蜡块固定在石蜡切片机上,使蜡块的切面与刀口成平行方向,刀的倾斜度通常为15℃,转动轮转推进器,调节切片厚度为6μm,切成厚度均匀的切片。

2.左手持毛笔,右手旋动切片机转把,切片带出来之后,用毛笔轻轻托起,再用眼科镊轻镊蜡片,以正面放入展片箱中,其水温40—43℃左右。待摊平整后捞片。

3.贴附切片 左手持载玻片之一端,垂直入水去附贴切片,右手用毛笔辅助推动,附贴至玻片上的三分之二处。

4.切片贴附后,放在空气中稍晾干,即可进行烤片。血块组织、皮肤组织须及时烤片。但对脑组织、脂肪组织待完全晾干后才能进行,这样可防止产生气泡而影响染色。烤片的温度以蜡溶解为准。也可以放置60℃烘箱内烘烤过夜。

实验注意事项

1.固定组织所用的固定液要充足,至少相当于标本总体积的5倍以上,标本容器及其口径有适当大小,使标本能原形进行固定,避免使标本遭受挤压。

2.组织块透明在制片中是很重要的环节,如果组织不能透明,其原因可能有脱水未尽、组织太厚、透明时间不够以及与某些组织本身性质有关等。所以应从多方面考虑,尽可能使组织达到透明目的。通常根据透明时间与眼观相结合判断透明程度。

3.凡是陈旧、腐败或干枯的组织不易制成好切片。

4.固定失时或固定不当的组织,染色时常出现核染色质着色浅、轮廓不清,出现程度不等的片状发白区。

5.组织脱水、透明和浸蜡过度,会造成组织过硬过脆,特别是小动物组织应严格控制。

6.切片刀不锋利,切片时会自行卷起或皱起,不能顺利连成长蜡带。切片刀有缺口,易造成切片断裂、破碎、不完整及刀痕等现象,不利于切片和观察。

7.组织切片机各个零件和螺丝应旋紧,切片刀应固定牢固,否则将会产生震动,以致出现切片厚薄不匀和横皱纹等现象。



责任编辑:病理超大组织固定大蜡块包埋切片HE染色实验外包
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