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【北京组织切片细胞周期细胞凋亡检测分析实验外包服务】

发布时间:2023-04-29 08:29:27  来源:北京优质北京组织切片细胞周期细胞凋亡检测分析实验外包服务技术服务  浏览:   【】【】【


提供专业优质北京组织切片细胞周期细胞凋亡检测分析实验外包委托技术服务

1、细胞有多种命运:增殖、分化、衰老、死亡(凋亡,坏死,焦亡,自噬性死亡等)、永生化。

2、细胞凋亡:指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。

3、细胞坏死:长期以来细胞坏死被认为是因病理而产生的被动死亡,如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。

4、细胞焦亡:又称细胞炎性坏死,是一种程序性细胞死亡,表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。细胞焦亡是机体一种重要的天然免疫反应,在抗击感染中发挥重要作用。细胞焦亡是由gasdermin(消皮素)介导的细胞程序性坏死。

5、自噬性死亡:是一种非凋亡性的程序性细胞死亡,其特征是在垂死细胞中利用自噬小体对细胞内容物进行降解。是胞质溶胶和细胞器被隔离到双层膜的小泡中,由此运送到溶酶体/空泡中降解,并使因此形成的大分子进行再循环的一个过程。


如今,细胞凋亡检测是目前非常热门的研究方向,它不仅可以用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究,还能应用于临床诊疗、新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及肿瘤的基因治疗等,对于相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价也具有举足轻重的地位。

细胞凋亡检测技术服务包括:Annexin V/PI双染检测细胞早期凋亡和TUNEL法检测细胞晚期凋亡。 可用于检测不同类型、不同处理方式、不同时期细胞凋亡状况及分析凋亡细胞比例 。

首先,我们先来看一下细胞凋亡和细胞坏死的区别:

在研究某个基因表达或者药物对细胞周期的影响,可以通过核酸染料PI标记DNA,以下和大家分享一下流式检测细胞周期原理和方法。

细胞周期(cell cycle):指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。

G0/G1期:有丝分裂发生,细胞分裂成两个细胞,进入下一个细胞周期,或者进入静止期(G0期),而G0期从DNA含量上无法与G1期区分,细胞开始RNA和蛋白质的合成,但DNA含量仍保持二倍体。

S期:DNA开始合成,细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。

G2期和M期:当DNA复制成为4倍体时,细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质,直到进入M期。从DNA含量我们同样无法区分G2期和M期。

Tunel 法应用

Tunel 是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

1.收集并调整细胞浓度为1×106/ml,取1ml单细胞悬液进行后续操作。 
1)贴壁细胞:小心吸除细胞培养液,用胰酶消化细胞,制备单细胞悬液。1000g离心3-5分钟,沉淀细胞。加入约1ml预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可以残留约50μl左右的PBS,以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。  
2)悬浮细胞:1000g离心3-5分钟,沉淀细胞。加入约1 ml预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,可以残留约50μl左右的PBS,以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。 
3)组织细胞:将组织块用剪刀剪成尽量小的小块后,用0.25%的胰酶消化0.5-1小时,经过200-400目筛网过滤得到单细胞悬液。1000g离心3-5分钟,沉淀细胞。加入约1 ml预冷的PBS,重悬细胞,再次离心沉淀细胞。如组织难以消化,可加入适量胶原酶。 
2.细胞固定:用预冷的75%乙醇4℃固定1 小时至过夜。固定时,在振荡器上轻轻振荡细胞,并缓慢滴加75%乙醇,直接加入会导致细胞团聚的现象,很难重悬成单细胞。或者先用冷PBS充分悬浮细胞,之后缓慢加入无水乙醇,使终浓度为70-75%。 
3.去除固定液:离心沉淀细胞,小心吸除上清,用冷PBS 洗涤细胞,再离心。重复几次以去除固定液。可以残留约50微升左右的PBS,以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞,避免细胞成团。 
4.加入500ul的CCAA溶液(PI染液)(engreen),轻轻混匀后4℃避光孵育30分钟。 
5.上机检测,记录激发波长488nm处红色荧光,进行分析。

细胞周期检测

原理

PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料,能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合,其结合的量与DNA的含量成正比例关系,用流式细胞仪进行分析,就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态,从而计算出各个期的百分含量。PI染色后,假设G0/G1期细胞的荧光强度为1,那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2,正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

protocol

  1. 细胞培养:六孔板种下细胞,每孔1.5*10^6个,细胞处于生长对数期,50-80%贴壁后换含药培养液(三复孔),处理相应时间后,收细胞检测(单次流式细胞仪检测,1份样品细胞数量约10e6)
  2. 细胞处理:胰酶消化含血清培养基中和,2000 rpm * 5 min,用预冷PBS重悬洗涤,小心地吸去上清,残留约50ul,不要倾倒;
  3. 细胞固定:1ml PBS充分重悬,成单细胞,轻轻边vortex,边缓慢滴加3ml预冷的无水乙醇,至终浓度75%,4度静置过夜(18-24h),-20度长期保存一个月(预约流式细胞仪)
  4. 将过夜固定好的细胞用预冷PBS 洗两次,2000rpm 5min去除 PBS 后加入200 ul PBS(约400ul),为减少细胞损失可用1.5ml离心。移至1.5ml EP管中, 轻轻弹击离心管底,以适当分散细胞,避免细胞成团。加入20 μLRNase(储存浓度25 mg/mL,PBS 稀释成1mg/ml,工作浓度50ug/ml),重悬细胞,37 ℃水浴消化 30 min;加入PI 20ul至终浓度50ug/ml(储存液浓度25mg/ml, PBS稀释1mg/ml加入10ul)锡箔纸包住,避光4度染色30min,24h内上机检测。充分混匀细胞,用 200 目滤网过滤后,便可利用流式细胞仪进行细胞周期。
  5. 数据的收集和分析
    流式检测和分析:用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光,同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。
    Viable cell---PI阴性Annexin V阴性细胞
    Early apoptotic cell ---PI阴性Annexin V阳性细胞
    Dead---PI阳性Annexin V阳性细胞

责任编辑:北京优质细胞周期检测分析细胞凋亡检测实验外包技术服务
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