NTA技术能够实现简单、快速，不破坏外泌体原始状态，并且再搭配相应滤光片，可以测量荧光抗体标记的外泌体来测定外泌体纯度，而且具有检测速度快的特点，每个样本只需5-10分钟。

目前主要的外泌体分离方法是依据外泌体直径、结构等特点进行富集，或对特定膜蛋白进行捕获，产物中不可避免包含一些其他类型的囊泡，需要对外泌体进行鉴定，以保证所研究的材料外泌体的浓度和纯度。2014年国际细胞外囊泡学会（ISEV）提出，外泌体鉴定分为三个层面：电镜鉴定形态学特征、NTA鉴定粒径和浓度、蛋白标志物。

Zetaview（Particle Metrix）可快速、稳定地进行外泌体粒径、浓度和纯度鉴定。其方法原理即纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），单一颗粒跟踪技术并结合经典微电泳技术（zeta电位）和布朗运动，利用Stockes-Einstein方程式计算出纳米颗粒的流体力学直径和浓度。NTA是国际细胞外囊泡学会（ISEV）和广大研究者认可的外泌体鉴定技术之一，NTA技术能够实现简单、快速，不破坏外泌体原始状态。并且再搭配相应滤光片，可以测量荧光抗体（如CD9, CD63, CD81等）标记的外泌体来测定外泌体纯度。而且具有检测速度快的特点，每个样本只需5-10分钟。

使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术测定 外泌体浓度、粒径大小及表型

在外泌体相关文献的粒径分析中主要有两种仪器，分别为 Malvern’s NanoSight NS300 和 Particle Metrix’ ZetaView（图一），这两种仪器对外泌体粒径的检测都是基于NTA（Nanoparticle Tracking Analysis）技术。它的原理是利用光散射和布朗运动的特性获得液体悬浮液中的样本粒度分布，目前 NTA 已被外泌体研究领域认可为外泌体表征手段之一。 我们知道外泌体是经由多泡体和细胞膜融合后释放到细胞外的囊泡小体，直径一般为 40-100nm，粒径小且容易受到破坏。传统技术上被用于表征微粒大小的方法有流式细胞技术法，动态光散射（DLS），电子显微镜检查法（TEM/SEM）等。在这之中又以流式细胞技术法应用最为广泛，实际上流式细胞仪的粒度下限约为 300nm 左右，虽然我们通过荧光标记可以扩展该检测限值，但粒度较小时，准确测定这类颗粒大小的能力严重受限。DLS 跟NTA的主要区别在于浓度范围，当浓度过低时，NTA 可以非常圆满的完成检测任务，而 DLS 只能检测浓度较高的样品。电子显微镜检测可以非常直观的看到样品的形貌大小，但是成本太高，且时间久不能保证样品制备后的完整性。相较于其他技术，NTA 技术的样本处理更简单、更能保证外泌体原始状态，检测速度也更快。

NTA 在检测时通过光学显微镜收集外泌体的散射光信号，观测一段时间内颗粒在溶液中做布朗运动的影像，并对每一个颗粒进行追踪和分析，再通过爱因斯坦方程式（图二）计算出外泌体的流体力学尺寸和浓度。
我们在检测过程中是直接追踪拍摄影像中的每一个颗粒，所以 NTA 对于复杂的样品的检测具有极高的分辨率，可以将不同大小的颗粒清楚的区分开来，这对外泌体的检测来说非常重要。NTA 测量浓度时，测量的结果取决于仪器参数的设定，恰当的参数设定可以保证不同大小颗粒都被我们的软件追踪到并参与计算。

NTA 有 405nm、488nm、532nm 和 635nm 四种不同波长的激光器可供选择，搭配相应的滤光片，让其具有分析荧光样品的能力。外泌体表面有特异的标志物，如 CD63、HSP70、 TSG–101 等蛋白分子的存在。在复杂背景条件下，使用荧光抗体标记外泌体，即可使用NTA的荧光测量功能实现对外泌体的测量，结果相较于流式细胞仪更加的可靠。

外泌体参与了各种疾病的发生发展过程，与介导血管再生、肿瘤细胞增殖、免疫逃逸等都脱不开关系，在医疗诊断方面具有巨大前景。相应的对外泌体的检测，变得尤为重要。NTA 技术对外泌体的检测具有实时观测、高分辨率、荧光分析等功能，检测数据快捷可靠，

Zetaview所具备的单一颗粒跟踪技术，结合经典微电泳技术和布朗运动成为现代的分析手段。自动校准和自动聚焦功能，让用户眼见为实，更加直观人性化。通过子体积的扫描，来自于数以千计的颗粒的zeta电位和粒径柱状图的结果就可以计算出来。此外，颗粒浓度也可以通过视频计数分析得到。

Zetaview的特点 - 全自动和无源稳定性

自动校准程序会持续工作，即便是样品池被取出后。防震动设计提高了视频图像的稳定性。通过扫描多个子体积并进行平均，就可以得到可靠的统计结果。有3种测量模式可供选择：粒径，zeta电位和浓度。样品池通道集成在一个插入式的盒子中，盒子可提供温度控制以及同管理单元的耦合。

• 自动扫描，*多可达100个子体积；

• 自动聚焦；

• 小巧，便于携带；

• 防震动；

• 光源从紫外线到红光；

• 插入式样品池；

理论

平移扩散常数可通过直接观测待测颗粒的布朗运动计算得到。通过测试电泳迁移率，可以得到zeta电位。

纳米粒子跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）

所有的光散射仪器，包括粒子跟踪技术，都存在一个问题：当颗粒大小低于100nm时，灵敏度会迅速的降低。动态光散射技术的*低检测限是0.5nm，对于纳米颗粒跟踪分析，其*低检测限是10nm。通常，DLS和NTA的主要区别就在于浓度范围。对于DLS，当样品浓度太低时，zetaview可以非常圆满的完成检测任务。相反，对于高浓度的样品，DLS方法会非常的适合。

测量范围

测量范围依赖于样品和仪器。对于金样品，颗粒跟踪技术的检测下限为10nm；相应的，如果样品的散射能力较弱，则检测下限会变得更大。假如样品稳定，不会沉淀或漂浮，zeta电位测量的粒径上限为50微米，对于粒径测量为3微米。

源于视频分析的颗粒计数

颗粒浓度可通过视频分析得到，并归一化处理，散射体积对粒径。可检测的*小浓度为10⁵粒子/cm³，**为10¹⁰粒子/cm³。对于200nm的颗粒，**体积浓度为1000ppm。

准确度和精度

Zeta电位：准确度5mv，精度4mv，重现性5mv；

粒度测试（对于100纳米的标准乳胶颗粒）：准确度6nm，精度4nm，重现性4nm；

浓度测试（100纳米的颗粒，浓度10Mio粒子/ml）：准确度0.8 Mio/ml，精度0.5Mio/ml，重现性1Mio/ml；

只要相机设置正确，样品处理适当，则以上所有的数据均有效。

方法

Zetaview激光散射显微镜对于低于1微米衍射极限100倍的纳米粒子是非常敏感的。

纳米颗粒在药物输送中的应用持续迅猛发展 纳米颗粒可提供优良的药代动力学特性长效和缓释以及特定细胞组织或器官的靶定 可利用的能用于疾病ZL的新生物活性化合物的发现速度在不断递减，这推动了人们对纳米颗粒药物输送的关注 每年进入市场的新药越来越少，利用纳米颗粒的多用途和多功能结构进行药物输送的兴趣正在迅速增长 所有这些特性都能够改善现有药物的疗治效果（Malam 等人，2011年）
用于药物输送的纳米颗粒已经被定义为亚微米级胶体系统，可以由各种组分中的各种物质构成 通常定义的纳米颗粒载体包括：脂质体胶束超支化高分子固体脂质纳米颗粒金属纳米颗粒半导体纳米颗粒和聚合物纳米颗粒 多种形式的纳米颗粒已被广泛用于将药物基因疫苗和诊断器械送入特定的细胞/组织 （Ram 等人，2011年）
考虑一个纳米材料药物输送系统时，纳米颗粒的粒度是一个关键参数，因为它会直接影响输送摄取降解和从身体清除的过程 例如，30 nm至几百nm直径的纳米颗粒能够因为血管渗漏而被动地聚集在肿瘤部位，吞噬作用只对大于500 nm的颗粒有效，而胆清除和肾清除分别发生在颗粒小于30 nm和小于8 nm时 此外，肝对较小的颗粒（25 nm和50 nm）的摄取率比对较大颗粒（200 nm和300 nm）的摄取率低 因此，受控颗粒的极ng确测定对于许多系统和过程都是必要的.