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【专业大小鼠海马侧脑室脑立体定位技术实验外包服务】

发布时间:2020-10-29 18:52:37  来源:专业大小鼠海马侧脑室脑立体定位技术实验外包服务价格优惠  浏览:   【】【】【


立体定位技术是很多实验的基础,为了使处理手段(给药、毁损等)或信号采集(微电极、探针)到达实验设计的位置。定位的难度主要看要定位核团的大小(决定定位的精确度)。

定位要做的第一件事是找一本适合的图谱,比如成年大鼠可用Paxinos & Watson 图谱。那么相应的你用的动物应该和图谱尽量一致(雄性Wister大鼠,290g左右,注意看intruduction)。
第二件事是调整定位仪和图谱一致,主要是调节门齿和耳杆连线的垂直位差,Paxinos & Watson 图谱是3.3mm
第三件事是查找自己定位核团的坐标。知道核团英文全称的话,在List of Structures中查找缩写,知道缩写的话直接在Index of Abbreviations中查到核团所在的页码(一个核团可占据多个页码)。翻到所在的页面,多是冠状切面,核团的宽度、高度可直接由图上坐标读出,核团的长度要看所占的页数。右下角有一个Bregma值,用第一页的这个数值减去最后一页的这个数值就是核团的长度。根据这些数据估算核团的大小。在各页面上挑选一个横截面最大的,在核团中心点一点,经这个点划水平线和垂直线,水平线和纵坐标的交点就是核团的深度坐标(颅骨下多少mm),垂直线和横坐标的交点就是核团左右坐标(中线旁开多少mm),右下角的Bregma值就是核团的前后坐标(正值代表前囟前,负值代表前囟后,前囟是骨缝冠状缝和矢状缝的交点)。定位时先定位到前囟,再根据刚才的坐标读数向前或向后、向左或向右、向下(先在颅骨上打孔)到达核团位置。
第四件事是验证定位的准确性,可以打点染料、或通电产生小毁损灶、推荐用玻璃微电极微电泳出旁胺天蓝,然后切片对照图谱。切片时注意尽量使切面角度和图谱保持一致,便于对照。方法如下,取一个平皿倒扣,一边垫高,使成一定角度,用自制的刀架(两把双面刀固定在一定厚度的有机玻璃两面,使平行的两刀间有一定得距离,用于切去一定厚度的组织)切出包含所要结构的组织块,注意左右对称;上冻台切片,先从所要结构以外开始切(还不到核团所在层面),切片对照图谱(对照物可选海马和视交叉,大而清晰;还可选择所需核团附近的特殊结构如纤维索),调节冻台角度,使切片角度与图谱一致。

第五就是多加练习,最后能根据你所用动物的体重对坐标做相应的修正,保证一定得准确率,立体定位也就成功了。


小鼠侧脑室给药的,用的是人的Aβ1-42,深度为颅骨表面向下2.5mm,下面资料上是2mm.处,一般都用的是人的Aβ,用25-35Aβ的便宜用大鼠的Aβ好像没听说过.  
Aβ致痴呆模型 
一、Aβ海马注射致脑内神经炎性反应模型的制备 

(1)实验材料 
动物:SD大鼠,200~250g;NIH小鼠,18~20g 
试剂:Aβ1-40/Aβ25-35为美国Sigma公司产品,麻醉药 
仪器:脑立体定位仪 

(2)实验步骤 
Aβ1-40/Aβ25-35肽段大鼠海马内注射:SD大鼠1%戊巴比妥钠麻醉,固定于脑立体定位仪上,头顶部去毛,消毒皮肤,头顶部正中切口,暴露前囟,按大鼠脑立位图谱,于前囟后3.0mm,中线右侧2.0mm处,微量注射器自脑表面垂直进针2.8mm,向双侧海马缓慢注入5μl(2μg/ul,用无菌生理盐水溶解Aβ肽段完之后分装,-20度保存,用的时候取出一管37度孵育7天),每侧注射时间5min, 留针2min,缓慢退针。所有操作均在无菌条件下进行,皮肤切开处用青霉素抗菌,缝合伤口。假手术组注射等量生理盐水。 
Aβ1-40/Aβ25-35肽段小鼠海马内注射:立体定向仪固定小鼠(bromega 2.3mm, L:1.8mm, V:2.0mm),根据所需注射部位,按小鼠脑立体定向定位,在钻孔后注射5ul,速度0.2ul/15秒,注射完毕后留针2min,然后每分钟退针1mm。整个注射过程不到10min,注射效果好,小鼠很快从麻醉(气体)中恢复。 
(3)注意事项: 
1、海马与记忆功能有关,AD患者住住以记忆障碍为首发症状,这与疾病早期海马的损害有关,将Aβ肽段注射入海马区,可模拟AD发病过程。推荐使用Aβ1-40,但Aβ25-35也是引起细胞毒炎性反应的重要肽段,且价格便宜,溶解性好。 
2、固定头颅时一定要准确插入双耳固定棒,不能太紧,也不能靠颈部,这样容易刺激迷走神经而引起呼吸停止,难以抢救, 
3、钻孔时一定要控制好,宁慢勿快,很容易在颅骨钻通后一不小心钻头进入脑组织。 
4、麻醉很关键。腹腔注射药物剂量不好掌握,药物用多了小鼠死亡率很高,鼠在手术过程中稍有挣扎,就会对定位有影响,且对操作不利。 

二、Aβ脑室内注射致痴呆模型的制备 
(1)实验材料 
动物:SD大鼠,200~250g;NIH小鼠,18~20g. 
试剂:Aβ1-40/Aβ25-35为美国Sigma公司产品 
仪器:脑立体定位仪 
(2)实验步骤 
Aβ1-40脑室注射大鼠:SD大鼠经腹腔注射10%的水合氯醛(0.4g/kg体重)麻醉后,固定于脑立体定位仪上,头顶部去毛,消毒皮肤,头顶部正中切口,暴露前囟,按大鼠脑立位图谱,向实验组大鼠第三脑室注射Aβ 5μl(2μg/ul,处理方法见前面所述),脑室立体定向坐标为:AP=-1mm,VD=4.5mm;微量注射器自脑表面垂直进针2.6mm,正常对照组为等量生量盐水,其它处理方法见前面所述。 
Aβ1-42脑室注射小鼠:用0.2mL0.4%戊巴比妥钠麻醉小鼠,将小鼠固定在定位仪上,剪开头顶部皮肤,酒精棉擦拭,暴露出前囟。采用右侧脑室定位,自前囟向后2mm,矢状缝旁开1.5mm处,即为侧脑室的体表部位。用微量注射器在此位置穿一小孔,深度为颅骨表面向下2.5mm处,每只小鼠以2μl/min恒速注射1.5μlAβ(2μg/ul)。生理盐水组小鼠注入1.5μL生理盐水代替Aβ。术后24h开始各组分别给予药物治疗,按每天每只小鼠0.2mL药液灌胃,生理盐水对照组为0.2mL生理盐水。 
(3)注意事项: 
1、有细胞毒的可溶性Aβ进入脑室,经侧脑室弥漫致全脑,更接近Aβ引起细胞毒作用的实际过程,推荐使用小鼠注射Aβ1-40,其较大鼠造模简单,Aβ用量少造价低。 
2、给药时间:(1)术前给药一周,术后给药一周(2)术后24小时 

---------几点说明------------ 
1.Aβ1-40是用无菌生理盐水还是双蒸水溶解的关键是看你实验的对照组海马或者其他部位注射的是无菌生理盐水还是双蒸水,如对照组用无菌生理盐水,那就用无菌生理盐水溶解,因为只有这样才有对照的意义。溶解的浓度要看你买回试剂的时候配置来调节。一般的制作AD模型时,每侧海马注射10ug,我的Aβ25~3 5(购于Sigma公司)用无菌生理盐水配制成2ug/uL,37℃下孵育一周,使其变为凝聚态Aβ25~35。,每侧海马注射5ul。 

2.Aβ1-40的注射部位,用的是海马或者侧脑室都可以,都有大量的文献报道模型制作成功,主要看你们实验室的习惯在哪个部位。不过我个人认为,注射在海马比较好,因为如果注射在侧脑室容易与脑脊液相溶,影响制作模型的成功。注射海马部位,Aβ停留在脑组织,易于吸收,模型易于成功。 

3.注射量10ug就可以了,量多其不是浪费。再说Aβ并不便宜。不过用于细胞的模型量就不一样了。比如pc12细胞。 

4.Aβ1-40溶解后的保存问题,用无菌生理盐水或者双蒸水溶解完之后分装-20度保存,用的时候取出一管37度孵育7天。孵育的目的是让Aβ25~3 5老化,使其变为凝聚态Aβ25~35。因为只有凝聚态Aβ25~35才能使AD模型制作成功。

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