分子生物医学病理组织细胞免疫组化双重免疫荧光染色扫描实验外包委托技术服务操作流程
一.固定、脱水、包埋
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取组织放入4%多聚甲醛里面固定3-4小时,时间根据标本大小适当调整。
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取适当大小组织放入包埋盒中,进行脱水。每个染缸液体体积约200ml,每次脱水可以装20个包埋盒。依次进入:
75%酒精1.5小时、95%酒精1.5小时、95%酒精1小时、无水乙醇1.5小时、无水乙醇1小时、二甲苯一号0.5小时、二甲苯二号0.5小时。
打开包埋机,分别开启冷台,冷点,石蜡槽,组织槽进行工作。然后用铁饭盒承装石蜡块并放入包埋机组织槽中加热溶解。将脱水后的组织连同包埋盒依次放入机器组织槽中,然后再放入石蜡饭盒一号进行第二遍浸蜡,然后石蜡饭盒二号,进行三次浸蜡。
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选大小符合的模具,先调整机器滴蜡的速度,不宜过快防止有气泡。然后在模具中滴入液体石蜡,然后从饭盒二号中拿出浸后的包埋盒,打开用镊子取出组织放入模具中。然后用包埋盒的另一半盖住模具,再滴入少许石蜡后放到冷台上冷却。按上述步骤继续包埋下一个蜡块。
二.切片、制片
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打开切片机,固定蜡块(可提前4度冰箱预冷一下),调整刀片和蜡块的距离。然后调整切片厚度,先粗切,看到完整的蜡片并且有组织后切换厚度,调整到自己想要切的厚度。用力均匀,右手摇动切片,左手用毛笔接片。如片子打卷,可以用毛笔按着蜡片的边缘再缓慢切,这样可以得到相对平整的片子。
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用毛笔和镊子将片子或者带状片子托起,放入水槽中展片,水温在40度左右。然后用防脱片载玻片轻轻捞起,载玻片的边缘尽量不要触碰水槽底部,防止底部气泡上浮残留在片子上。然后标注切片编号放到烤片机上烤片30分钟。
三.组织化学染色
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室温脱蜡、水化:二甲苯一号10分钟、二甲苯二号8分钟、二甲苯三号8分钟、无水乙醇5分钟、90%乙醇3分钟、80%乙醇3分钟、70%乙醇3分钟。蒸馏水3分钟*3次,PBS3分钟*3次。
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热抗原修复,换新的切片架,放入水化后的切片。配置抗原修复液(一包柠檬酸钠粉末配置2升PBS溶液),用铁饭盒或者锅加热煮沸。温度控制在96-98度。然后将切片放入热锅中15分钟,最后自然冷却室温。PBS五分钟*2次,蒸馏水3分钟*2次。
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免疫组化笔画圈:取出组织,甩干水分,可用吸水纸吸干水珠。用组化笔画圈围住组织,圆圈完整。
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灭活内源酶活性:将切片放入湿盒中,盒中加入少量蒸馏水,滴加3%过氧化氢(二抗试剂盒中A一滴或者50微升,剂量详见二抗说明书),室温孵育10分钟。PBS三分钟*3次,蒸馏水水洗三分钟。
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封闭非特异性位点:甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封闭液(二抗试剂盒B一滴或者50微升),放入湿盒内,室温10分钟。
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甩掉封闭液,滴加一抗盖住组织,然后放入湿盒内4摄氏度过夜。(一抗浓度见抗体说明书,提前稀释后分装,并在负二十度冰箱保存。每张片子一抗剂量不定,看组织面积大小,xxxxx癌组织一张20微升左右。
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第二天,4度冰箱取出湿盒,室温复温30分钟,PBS三分钟*三次,蒸馏水洗涤三分钟。
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甩干水分,吸干水珠,滴加二抗(二抗试剂盒C)一滴或者50微升,室温孵育10分钟。PBS三分钟*三次,蒸馏水水洗三分钟。
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每张片子滴加一滴或者50微升链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(二抗试剂盒D),室温孵育10分钟,PBS三分钟*三次,蒸馏水水洗三分钟。
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每张片子滴加两滴或者100微升DAB溶液,显微镜下观察3-10分钟。染色合适即可终止染色,自来水冲洗。
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苏木素复染,1-2分钟,细胞核变蓝色即可终止,自来水或者PBS冲洗反蓝(可用0.5%氨水反蓝)。
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1%盐酸酒精分化3秒,自来水冲洗三分钟。
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脱水:70%酒精1分钟、80%酒精1分钟、95%酒精2分钟、无水乙醇4分钟、二甲苯一号3分钟、二甲苯二号3分钟。
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凉干片子后滴加适量中性树胶封片,盖上盖玻片,小心气泡。晾干半天即可。
显微镜下拍照。
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