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一、实验目的

衰老是生物体在细胞、组织、器官结构与功能上表现出来的各种衰退过程的总称,是一个自发而又与早期的程序化发育相对应的过程。其结果是导致个体存活力下降直至死亡。且该过程是不可逆的。人口老龄化是老年人口占总人口比例随时间推移而不断上升的一种动态过程,人口老龄化的总趋势是老龄化的程度日趋加重。根据联合国1982年的报告。在1950~2050年的100年间,全世界的老年人口将出现大幅度增长,而事实上,我国从20世纪70年代初生育率开始下降之时起,人口老龄化就已经开始了。至1982年。我国人口已经完成了从年轻型人口向成年型人口转变,预计到2025年,15岁以下的儿童将占总人口的18.6%,65岁以上的老人将超过18.8%,即每5个人中就有1个老年人。到21世纪末。我国将成为老年型人口国家。脑老化是渐进的、不可逆的生理功能全面下降的过程。其结果直接与多种老年性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等密切相关,极大地影响了老年人的生活质量,给社会和家庭带来巨大的负担,对人类的发展将产生深刻影响。

脑衰老伴随的认知功能损害是人类机体老化的突出表现之一,并可影响全身的衰老,成为影响人类生活质量的主要原因。但脑衰老的分子机制至今仍不十分明确。一直以来。很多学者都致力于衰老机制的研究,以期寻找出对抗衰老的有效途径。衰老的机制是十分复杂的,但是,直到现在,还没有一种学说体系可以全面解释衰老的现象,人们对于延缓老化及衰老相关疾病的治疗仍未找到有效线索。自从发现应用某些抗生素可抑制学习、记忆形成,长期记忆过程需要蛋白质参与后,从基因水平探索学习、记忆的分子机制已成为神经生物学家广泛关注的焦点。而随着各项研究的进展,有学者提出,只有在分子水平了解衰老的机制才能找到有效延缓衰老的方法,而快速老化小鼠的引入为这样的研究提供了良好的平台。    快速老化小鼠(senescence accelerate mouse, SAM)是日本京都大学Takeda教授经20多年精心培育而得到的一种近交系衰老模型鼠,包括SAMP(senescence accelerated-prone mouse)和SAMR(senescence accelerated resistant mouse)两种品系。SAMP在渡过一段正常生长期(4~6月龄)后迅速出现行动反应迟缓、被毛光泽减退、脱毛、皮肤溃疡、眼周损害、角膜溃疡、白内障、脊柱弯曲等老化特征。SAMR表现为正常衰老,一般作为SAMP的正常对照。快速老化痴呆模型小鼠SAMP8是SAMP系中的一个亚系,主要以学习、记忆能力障碍为老化特征,是目前公认的比较理想的自然衰老痴呆模型。迄今为止,SAM己被广泛用于衰老相关性疾病及分子机制的研究。本节主要介绍该品系小鼠在笔者实验室的建系及表型检测,为进一步深入理解老化和痴呆的机制提供帮助。

二、实验原理

神经行为学实验是研究动物学习、记忆能力障碍的主要方法。其基本原理是利用动物觅食、求生、逃避伤害、喜暗恶明等本性设计实验,观察其近期和远期学习记忆能力,评估其痴呆状态。其方法主要有Morris水迷宫实验、八臂迷宫实验、明暗箱实验、穿梭箱实验、高架桥实验、跳台实验等。

本研究运用Morris水迷宫检测了不同月龄SAMP8学习、记忆功能的变化,结合老化度评价的结果,检测笔者实验室繁殖出的SAMP8是否建系成功,以及是否具有自然快速老化的特征,为今后的研究提供实验动物模型。

三、实验材料与方法

(一)实验材料

1.所需实验仪器  小鼠Morris水迷宫设备及软件。

2.实验动物  SAMP8及SAMR1种鼠由中国医学科学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室张连峰教授惠赠,在昆明医科大学繁殖并进行表型检测。本研究随机选取2月龄、6月龄、10月龄SAMP8各8只,同月龄SAMR1作为对照,每组中雌雄各半,经过老化度评分后进行Morris水迷宫检测。

(二)实验具体方法和操作步骤

1.老化度评分  参考文献老化度评分标准,从反应性、被动性逃避反应、皮毛光泽、皮毛粗糙度、脱毛程度、皮肤溃疡、眼周损害、角膜浑浊、角膜溃疡、白内障、脊柱后凸等11项指标对各组动物进行客观评分。每项指标划分为4~5级不等,标定分值。动物积分越高表明其老化度越高。

2.行为学评价  利用Morris水迷宫进行小鼠行为学分析。水迷宫实验过程为第1天可视平台训练。连续5d的隐藏平台获得实验和第6天的空间探索实验3部分。每天训练3次,每次使小鼠在不同区域下水,Morris水迷宫按东南西北分为1、2、3、4区域,平台即第5区域。位于第4区域内。每次游泳时间60s,每次训练间隔1h左右。小鼠没有找到平台按60s计算逃避潜伏期。隐藏平台获得实验检测小鼠学习获得能力,空间探索实验检测小鼠空间记忆能力。

MWM为一直径160cm、高50cm的圆形水池,水池内壁被漆成黑色,池内水深23cm,水温保持在(22±2)℃,房间内光照恒定,无光线直射在水池内。池壁上以4个等距离点将水池分为4个象限,在靶象限(设为第l象限)内距离池壁35.cm处放有一个直径为12cm、高21cm的圆形白色站台,站台在实验开始时位于水面上0.5cm。池壁内贴有不同形状及颜色的标记物,每天实验前将无毒可溶的白色染料加入水中混匀。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机。同步记录小鼠运动轨迹。

3.可视平台实验  将平台升至水面上0.5cm,实验前将小鼠置于站台上适应20s,随后将小鼠随机从不同象限(靶象限除外)面壁置入池内,小鼠登上站台3s后终止记录,最长记录时间为60s,若小鼠在60s内不能上台,引导其登上站台适应30s,记录为60s,最后将小鼠擦干放入鼠笼。

4.隐蔽平台实验  可视平台实验1d后将站台降至水面下0.8~1cm,然后将小鼠随机从不同象限(除靶象限外)面壁置入池内3次,每次记录小鼠在60s内的游泳轨迹并进行分析,小鼠登上站台3s后终止记录,最长记录时间为60s,若小鼠在60s内不能上台,引导其登上站台适应30s,记录为60s,最后将小鼠擦干放入鼠笼。如此将小鼠置入游泳池,3个不同的象限入水点为一只小鼠一天训练的数据。每天选择的入水点应避免与前一天重复。测量平均上台潜伏期,以评判小鼠的空间学习能力。该项训练持续5d,在第6天开始进行空间探索实验。

5.空间探索实验  隐蔽平台实验结束后撤除水面下的站台,然后将小鼠随机从不同象限(除靶象限外)面壁置入池内3次,每次记录小鼠在60s内的游泳轨迹并进行分析,最后将小鼠擦干放入鼠笼。测量小鼠在靶象限活动时间的比率和穿越站台次数,以评判小鼠的空间记忆能力。

(三)实验操作中的注意事项

SAMP8抵抗力较差,尤其是高龄组的小鼠,对外界环境的温差变化较为敏感,护理不当容易死亡,因此,每次完成Morris水迷宫测试之后,要及时将小鼠的毛皮擦干,避免受凉导致死亡。

四、获得的实验结果

(一)老化度评分

SAMP8和SAMR1两组小鼠老化度评分值均随年龄增长而增高。但SAMR1组小鼠随年龄增高老化度评分值增高不显著(P>0.05),而SAMP8组小鼠6月龄、10月龄的评分值较同组2月龄小鼠显著增高(P<0.05)。与对照SAMR1组相比,SAMP8在6月龄、10月龄的评分值显著高于同龄对照组(P<0.05)。表明两组小鼠在1~12个月生存期间内,SAMR1组并未出现明显的衰老表征,而SAMP8组从6月龄时即迅速出现明显的衰老征象,比 SAMR1提前进入衰老期。

(二)Morris水迷宫检测

经过检验,前6d学习有效,所有小鼠都能较快地找到平台。随后第7天撤出平台,进行空间探索实验。用Ethovision XT监测分析软件记录小鼠在目标区域的停留时间。

Morris水迷宫实验发现,6月龄及10月龄高表达SAMP8隐蔽平台实验及空间探索实验结果与同月龄SAMR1相比有显著差异,与同月龄SAMP8相比,SAMR1均能在较短时间内找到平台(P<0.05,图15-6B和C);同样,在空间探索实验中,与SAMP8相比,SAMR1在目标象限停留时间最长(P<0.05,图15-6E和F),与对照组相比有统计学差异P>0.05),而2月龄SAMP8与SAMR1组相比无显著性差异(P>0.05,图15-6A和D)。

五、结果分析

(1)老化度评分是从外在形体及行为变化来评定机体的老化程度,反映了机体的衰老征象。从各组SAM的评定结果看,SAMP8组与SAMR1组在2月龄时评分差异无显著性,而在6月龄、10月龄时SAMP8组得分均显著高于SAMR1组。表明SAMP8组小鼠是经过一段成熟期后进入快速衰老期而出现明显衰老征象的。

(2)Morris水迷宫实验于20世纪80年代初由英国心理学家Morris设计。旨在用于检测动物空间搜索和辨别的学习、记忆能力,以动物找到暗台的逃避潜伏期作为评定学习、记忆能力的指标。本研究所得实验结果显示。第1天、第2天各组SAM找到暗台的潜伏期均呈下降趋势,说明均具有一定的学习能力,但从第2天开始到第6天,6月龄、10月龄 SAMP8小鼠的潜伏期显著长于同龄SAMR1组。提示6月龄、10月龄SAMP8小鼠学习、记忆能力可能比同龄SAMR1组小鼠差,在空间记忆和辨别能力方面6月龄、10月龄SAMP8仍存在一定的障碍。说明笔者实验室繁育的SAMP8稳定遗传了自然快速老化的特征,可以作为研究老化相关疾病的动物模型。


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