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【提供北京专业优质细胞克隆形成实验外包技术服务】

发布时间:2021-08-06 20:18:31  来源:提供北京专业优质细胞克隆形成实验外包技术服务  浏览:   【】【】【


细胞克隆形成实验服务流程

A.平板克隆形成实验:适用于贴壁生长的细胞。
1. 取对数生长期的各组细胞,制备细胞悬液。
2. 将细胞悬液作梯度倍数稀释,分别接种含培养液的皿中,培养2-3周。
3. 经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。
4. 弃去上清液,4%多聚甲醛固定,GIMSA染色液染10-30 min。
5. 计算克隆形成率,克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)× 100%。
6. 结果统计分析。
B.软琼脂克隆形成实验:适用于非锚着依赖性生长的细胞。
1. 制备细胞悬液,梯度倍数稀释。
2. 分别制备1.2%和0.7%琼脂糖溶液。
3. 下层琼脂凝固后放入37℃培养箱备用。
4. 加入细胞悬液,待上层琼脂凝固后,培养10-14天。
5. 计算克隆形成率,克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)× 100%。

6. 结果统计分析。

克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法。所谓克隆是指单个细胞在体外持续增殖6代以上其后所形成的细胞群,形成肉眼可见的克隆。通过计数得出克隆形成率,可对受检细胞的增殖潜力作定量分析


缺点:操作繁琐。优点:精确、可靠。


应用:常用于抗肿瘤药物敏感性测定、基因治疗、肿瘤放射生物学等方面的研究。


方法:平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。


计算公式:

克隆形成率比=克隆形成数/接种细胞数


克隆形成率

细胞接种存活率:只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率:反映细胞群体依赖性增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同, 细胞克隆形成率差别也很大,一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系,做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在碟皿中,持续一周,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养。



平板克隆形成实验


平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞(细胞生长快慢均可)。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度,所以细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大


001 操作步骤

  • 取对数生长期的单层培养细胞, 用0.25% 胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞, 把细胞悬浮在 10% 胎牛血清的培养液中备用。

  • 将细胞悬液作梯度倍数稀释,以适当的细胞密度(根据增殖能力 )接种于培养皿中。一般分每皿 50、100、 200 个细胞的梯度密度分别接种含 10mL 37 ℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置 37℃5% CO2 及饱和湿度的环境下,静置培养 2~3 周


  • 经常观察,当培养皿中出现肉眼可的克隆时,终止培养。弃去上清液,用 PBS 小心浸洗 2 次。加纯甲醇或【1:3的 醋酸 /甲醇 】5mL,固定 15 分钟。然后去固定液,加适量 Giemsa 应用染色液染 10~30 分钟, 然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。


  • 将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片, 用肉眼直接计数克隆,或在显微镜 (低倍镜 )计数大于 10 个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。


002 注意事项

  • 要根据细胞增殖能力设计梯度。一般每孔按50、100、200个细胞的梯度密度设计。


  • 终止培养时间以不少于2周而且克隆之间不发生融合为标准。


  • 试验成功的关键是细胞悬液的制备接种密度细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大



03 软琼脂培养克隆形成试验


原理:让细胞处于不贴壁以及单细胞状态,模拟体内细胞处于半固液的情况,在此情况下检测细胞的增殖能力。单细胞处于软琼脂中,就如同胰酶消化后的状态,此后,细胞继续增殖分裂,形成单克隆。适用于悬浮生长的细胞以及繁殖较快的贴壁细胞。


001 操作步骤

  • 用蒸馏水分别制备出 1.2% 和 0.7% 两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后置于55℃的水浴锅中,目的是为了使其保持融化状态


  • 配制含20%FBS、2X双抗的2X1640培养基,用0.22微米的滤器过滤除菌


  • 铺下层胶:1.2%的琼脂糖胶与 2x 培养基 (含有 2×抗生素和 20% 的小牛血清 )1:1混合,加入到6孔板中,每孔1.5mL,室温等其凝固。


  • 细胞计数:将细胞用PBS的洗一遍,用胰酶消化,终止后离心,加入新的培养基混匀稀释,调整细胞浓度为5X104/mL。


  • 铺上层胶:0.7%的琼脂糖胶与2x培养基1:1混合,加入100uL的细胞悬液,即5000个细胞,混合均匀后,每孔加入1.5mL。


  • 放入37℃,5%CO2,培养箱培养,隔三天后补加培养基,约3周后收细胞。


  • 计数比较对照组与实验组的细胞数量,最后进行分析,计算单克隆形成率


002 注意事项

  • 琼脂法所用琼脂应为低熔点琼脂。配好的琼脂要放在水中预温,下层琼脂水温在50-60℃之间,上层琼脂水温不要超过42℃;


  • 应使下层琼脂充分凝固后,再浇上层琼脂,以避免上层琼脂培养基中的细胞进入下层琼脂中;


  • 浇上层琼脂时操作要迅速,以免液体过凉导致上下分离;


  • 操作中不能产生气泡


结语


由于克隆实验难获得真正单细胞悬液,有些肿瘤细胞集落形成率低,确定集落有一定难度耗时长,重复性差,所以祝大家实验顺利!



责任编辑:提供北京专业优质细胞克隆形成实验外包技术服务
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