【北京细胞克隆形成细胞周期细胞凋亡检测实验外包服务】

至善北京医学研究院提供优质专业细胞克隆形成细胞周期细胞凋亡检测实验外包委托技术服务

细胞克隆形成实验服务流程

A．平板克隆形成实验：适用于贴壁生长的细胞。
1. 取对数生长期的各组细胞，制备细胞悬液。
2. 将细胞悬液作梯度倍数稀释，分别接种含培养液的皿中，培养2-3周。
3. 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
4. 弃去上清液，4%多聚甲醛固定，GIMSA染色液染10-30 min。
5. 计算克隆形成率，克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）× 100%。
6. 结果统计分析。
B．软琼脂克隆形成实验：适用于非锚着依赖性生长的细胞。
1. 制备细胞悬液，梯度倍数稀释。
2. 分别制备1.2%和0.7%琼脂糖溶液。
3. 下层琼脂凝固后放入37℃培养箱备用。
4. 加入细胞悬液，待上层琼脂凝固后，培养10-14天。
5. 计算克隆形成率，克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）× 100%。

6. 结果统计分析。

细胞克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法。所谓克隆是指单个细胞在体外持续增殖6代以上其后所形成的细胞群，形成肉眼可见的克隆。通过计数得出克隆形成率，可对受检细胞的增殖潜力作定量分析。

细胞克隆形成实验缺点：操作繁琐。优点：精确、可靠。

细胞克隆形成实验应用：常用于抗肿瘤药物敏感性测定、基因治疗、肿瘤放射生物学等方面的研究。

细胞克隆形成实验方法：平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。

细胞克隆形成实验计算公式：

克隆形成率比=克隆形成数/接种细胞数

细胞克隆形成实验克隆形成率

细胞接种存活率：只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。

克隆形成率：反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同， 细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在碟皿中，持续一周，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

平板克隆形成实验

平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞（细胞生长快慢均可）。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度，所以细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大

001 操作步骤

• 取对数生长期的单层培养细胞， 用0.25% 胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞， 把细胞悬浮在 10% 胎牛血清的培养液中备用。

• 将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度(根据增殖能力 )接种于培养皿中。一般分每皿 50、100、 200 个细胞的梯度密度分别接种含 10mL 37 ℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置 37℃5% CO2 及饱和湿度的环境下，静置培养 2～3 周。

• 经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用 PBS 小心浸洗 2 次。加纯甲醇或【1:3的 醋酸 /甲醇 】5mL，固定 15 分钟。然后去固定液，加适量 Giemsa 应用染色液染 10～30 分钟， 然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

• 将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片， 用肉眼直接计数克隆，或在显微镜 (低倍镜 )计数大于 10 个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

002 注意事项

• 要根据细胞增殖能力设计梯度。一般每孔按50、100、200个细胞的梯度密度设计。

• 终止培养时间以不少于2周而且克隆之间不发生融合为标准。

• 试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

03 软琼脂培养克隆形成试验

原理：让细胞处于不贴壁以及单细胞状态，模拟体内细胞处于半固液的情况，在此情况下检测细胞的增殖能力。单细胞处于软琼脂中，就如同胰酶消化后的状态，此后，细胞继续增殖分裂，形成单克隆。适用于悬浮生长的细胞以及繁殖较快的贴壁细胞。

001 操作步骤

• 用蒸馏水分别制备出 1.2% 和 0.7% 两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后置于55℃的水浴锅中，目的是为了使其保持融化状态。

• 配制含20%FBS、2X双抗的2X1640培养基，用0.22微米的滤器过滤除菌。

• 铺下层胶：1.2%的琼脂糖胶与 2x 培养基 (含有 2×抗生素和 20% 的小牛血清 )1：1混合，加入到6孔板中，每孔1.5mL，室温等其凝固。

• 细胞计数：将细胞用PBS的洗一遍，用胰酶消化，终止后离心，加入新的培养基混匀稀释，调整细胞浓度为5X10⁴/mL。

• 铺上层胶：0.7%的琼脂糖胶与2x培养基1：1混合，加入100uL的细胞悬液，即5000个细胞，混合均匀后，每孔加入1.5mL。

• 放入37℃，5%CO2，培养箱培养，隔三天后补加培养基，约3周后收细胞。

• 计数比较对照组与实验组的细胞数量，最后进行分析，计算单克隆形成率。

002 注意事项

• 琼脂法所用琼脂应为低熔点琼脂。配好的琼脂要放在水中预温，下层琼脂水温在50-60℃之间，上层琼脂水温不要超过42℃；

• 应使下层琼脂充分凝固后，再浇上层琼脂，以避免上层琼脂培养基中的细胞进入下层琼脂中；

• 浇上层琼脂时操作要迅速，以免液体过凉导致上下分离；

• 操作中不能产生气泡。

结语

由于细胞克隆形成实验难获得真正单细胞悬液，有些肿瘤细胞集落形成率低，确定集落有一定难度耗时长，重复性差，所以祝大家实验顺利！