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app/ps1双转基因小鼠英文名：	APP/PS1 transgenic mice
app/ps1双转基因小鼠保存条件：	20-26℃
app/ps1双转基因小鼠规格：	各种SPF级别

参考文献

参考文献

1.Jankowsky JL; Fadale DJ; Anderson J; Xu GM; Gonzales V; Jenkins NA; Copeland NG; Lee MK; Younkin LH; Wagner SL; Younkin SG; Borchelt DR. 2004. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Hum Mol Genet 13(2):159-70. [PubMed: 14645205] [MGI Ref ID J:87691] 2.Jankowsky JL; Slunt HH; Ratovitski T; Jenkins NA; Copeland NG; Borchelt DR. 2001. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng 17(6):157-65. [PubMed: 11337275] [MGI Ref ID J:78664] 3.Reiserer RS; Harrison FE; Syverud DC; McDonald MP. 2007. Impaired spatial learning in the APP + PSEN1DeltaE9 bigenic mouse model of Alzheimer’s disease. Genes Brain Behav 6(1):54-65. [PubMed: 17233641] [MGI Ref ID J:116798]

APP/PS1双转基因小鼠利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为：
(1) 构建基因打靶载体；
(2) 将基因打靶载体通过一定的方式(常用电穿孔法) 导入同源的胚胎干细胞中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组,将打靶载体中的DNA 序列整合到内源基因组中从而得以表达；
(3) 筛选发生同源重组的阳性克隆，通过显微注射或者胚胎凝集的方法将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内制作嵌合体小鼠，在生物活体中研究特定基因的功能。基因敲除小鼠使得研究者们能够观察到某一特定基因完全失活后小鼠表型的改变，从而推断出特定基因的作用。
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)又称老年性痴呆,是一种常见的中枢神经系统退行性疾病。随着社会人口的老龄化,AD的发病率呈不断上升趋势,已成为危及老年人生命的第四大病因(仅次于心脏病、肿瘤和中风),成为当前老年医学所面临的最为严峻的问题之一。有资料显示,预计到2050年,我国65岁及以上老人约占总人口的35%,80岁及以上老人约为22%,而AD患者预期可达到2500万,将成为影响家庭和社会发展的一个重要制约因素[1]。由于AD的病理机制非常复杂,病因迄今尚不清楚,亦缺乏有效的治疗措施,因此,积极研究AD的发病机制,开发有效防治AD的药物是当今老年疾病研究领域的重要课题之一。
AD转基因小鼠模型的建立标志着人类对AD的研究已取得重要进展,被评为近10年来人类疾病研究所取得的十大杰出成就之一,为AD的发病机制研究和筛选新的治疗药物提供了有效的模型系统[2]。目前,AD转基因小鼠模型主要包括淀粉样蛋白前体(APP)、tau、抗神经生长因子以及多基因共表达等,其中APP转基因小鼠是目前国内外较公认、应用最广泛、研究最深入的AD转基因模型之一,为进一步应用中医药防治AD的研究奠定了基础。

1.APP/ps1双转基因小鼠痴呆模型病理特点

AD动物模型的研究作为AD研究中极为重要的一环,已成为近年医学界的研究热点之一。随着转基因技术的不断发展,AD转基因动物模型成为AD研究热点并逐渐成熟。APP转基因动物模型建立在APP基因突变导致β淀粉样蛋白(Aβ)沉积是AD病理改变的中心环节的学说基础上,动物过多地表达APP基因或其突变基因产物,即可较早地引起Aβ的沉积和相关的病理损害或症状,可望为研究AD发病机制及治疗药物筛选提供较理想模型。研究表明,AD的形成与脑内多种调控基因失调密切相关,其中APP基因异常代谢与产生Aβ沉积和记忆缺失这一假说已被许多研究结果所支持[3]。
Dewachter等[4]研究发现,APP转基因小鼠模型能够较好地模拟老年斑(SP)的病理学改变：Aβ沉积部位以海马和皮层为主,伴星形胶质细胞反应性增生,营养不良性神经元增多,突触缺失,且SP的密度随鼠龄的增加而增多。Song等[5]运用弥散张量成像技术观测到APP转基因鼠大脑灰质和白质均有损害,且Aβ沉积量随年龄增长而逐渐增多。秦氏等[6]研究发现,APP695转基因小鼠在3月龄时跳台实验、水迷宫实验与对照组(C57BL/6J小鼠)比较有统计学意义(P＜0.01),且随着时间的延长,APP695转基因小鼠行为缺陷日渐明显,该现象符合由轻度认知损害向老年痴呆发展的规律。病理形态学研究亦表明,该模型早期大脑皮层及海马并未出现因淀粉样蛋白沉淀而形成的SP,淀粉样沉淀在6～9月之间形成较快,之后出现典型的SP。说明在疾病的发病进程中,会有一个淀粉样沉淀加速形成的时期。因此,该模型存在一个由认知功能损害向较典型AD进展的过程,在淀粉样沉淀加速形成之前,观察药物干预对该模型的认知功能及沉淀发生机制的影响,可能会有助于药物早期干预疾病进程的研究。

2.中医药防治痴呆的现状及其优势

AD属中医“善忘”、“健忘”、“呆病”、“痴呆”等范畴,关于其病机,历代医家也有阐释。如明代《景岳全书》载：“痴呆证,凡平素无痰,而或以郁结,或以不遂,或以思虑,或以惊恐而渐致痴呆。”《医学从众录》亦指出：“肾为肝之母而主藏精,精虚则脑海空虚而头重。”清代名医王清任在总结前人经验的基础上则明确指出：“脑为元神之府,灵机记忆在脑不在心……年高无记性,脑髓渐空。”
目前,AD的中医临床治疗主要包括传统方剂研究、辨证论治研究、单味药及有效成分研究以及针灸治疗等方面,其中辨证论治是中医的精华与特色所在,相关研究颇为丰富。如邓氏[7]以自拟补肾益脑汤治疗肝肾阴亏痴呆症,治疗20例,总有效率为95%,治疗前后脑电图、血脂及红细胞C3b受体花环率明显改善。颜氏等[8]根据“脑髓者,纯者灵,杂者钝”理论,认为瘀血为致呆的主要因素,主张以化瘀通络为大法,应用癫狂梦醒汤或益气聪明汤合通窍活血汤治疗,疗效显著。董氏等[9]用补肾活血法治疗老年期痴呆48例,总有效率为89.58%。本课题组前期通过系统的文献研究并结合多年的临床经验,提出“虚-瘀-浊-毒”为AD的病机基础,并据此拟定了防治AD的中药组方——还脑益聪方。通过随机、双盲、阳性平行对照临床实验表明,还脑益聪方疗效肯定,治疗后的临床记忆量表积分值明显提高,中医临床症状明显改善,对患者大脑前、后动脉的平均血量参数均有明显提高作用,还能显著升高老年轻度认知功能损害(mild cognitive impairment,MCI)患者血清超氧化物歧化酶(SOD)活性,同时降低乙酰胆碱酯酶(AchE)、白细胞介素-1α(IL-1α)及白细胞介素-6(IL-6)的血清含量,与对照组比较差异有统计学意义[10]。
上述研究表明,中医药防治AD具有较好的临床疗效,中药复方可发挥多途径、多环节、多靶点、多向调节的优势,通过预防和治疗的双重作用而达到防治AD的目的,提示中医药防治AD具有良好的前景。

3.应用建议

AD的临床综合征是其漫长病程的后期阶段,各种致病因子和保护因子在不同时期的相互作用,最终导致AD的神经病理改变和临床表现。AD确诊时已存在明显的不可逆神经元损害,所以,预防性治疗应在临床前期尽早实施,即在明确的AD病理改变之前就给予干预,以争取更好的治疗效果。因此,早期筛选MCI患者进行预防性治疗,对减缓或逆转痴呆的脑功能损害具有重要的意义,这与中医“不治已病治未病”的理论不谋而合。APP转基因小鼠痴呆模型的病理特点具有自然发生、逐渐加重、病理变化典型的优势,而中医认为AD的发病机理与“先天不足”、“后天失养”等密切相关,二者之间似有相通之处。而由于AD是多因素导致的复杂性疾病,任何一种作用于单靶位的药物都不可能取得较为满意的结果,因此,研发多靶点协同作用的药物有望取得较好的疗效。
目前,在中医药防治AD的领域,以APP转基因小鼠为模型相关研究较少,仅见散在中药复方或有效成分应用于该模型的报道,观察指标亦较单一。如张氏等[11]以APP转基因小鼠为模型,发现中药复方参乌胶囊(含何首乌、人参、石菖蒲等6味中药)及中药何首乌中有效成分二苯乙烯苷不仅能早期预防该模型学习记忆障碍的发生,还能逆转和治疗已出现的学习记忆障碍。邢氏等[12]进一步研究发现,参乌胶囊还能明显减少APP转基因小鼠脑内海马区APP的表达,减少脑内Aβ的产生,抑制β分泌酶(BACE)和早老蛋白(PS-1)的表达。楚氏等[13]观察了中药有效部位淫羊藿黄酮对10月龄APP转基因小鼠学习记忆功能和脑内APP、BACE的表达及Aβ生成及含量的影响。结果发现,淫羊藿黄酮大剂量可明显改善10月龄APP转基因小鼠Morris水迷宫作业成绩,提高模型鼠物体识别能力,明显减少APP转基因模型小鼠海马和皮层APP及BACE的表达,降低海马Aβ1-42的含量。提示淫羊藿黄酮能改善APP转基因模型小鼠学习记忆能力和减少Aβ经由淀粉源途径生成及含量,对防治AD等神经退行性疾病具有良好的应用前景。
笔者认为,在现有研究基础上,结合AD病理特点、中医病因病机及临床用药进行有效组方,以较理想的APP转基因小鼠为模型,在充分考虑相关筛选指标的特异性、敏感性和稳定性的基础上,观察有效中药或方剂对该模型不同时程行为学、病理形态学及相关蛋白表达、细胞凋亡、氧化应激反应、炎症因子等多环节的影响,在进一步研究和开发防治AD或MCI的中医药方面具有较好的前景。

4.展望

21世纪将是预防医学大发展的时期,对AD这类慢性病的提前预防干预,将起到“事半功倍的效果”。目前,虽然缺乏能全面反映和模拟老年性痴呆病理、生化、行为学等方面的全部特征的AD动物模型,但APP转基因小鼠在病理学、行为学等方面的改变已明显优于其他非转基因模型,且存在一个由认知功能损害向较典型AD进展的过程,特别适合发挥中医药多靶点作用,进行早期干预和动态观察。相信随着人们对APP转基因小鼠研究的的不断深入,将产生更为接近人AD病理和发病过程的多重转基因模型,为进一步研究开发防治AD有效中药制剂起到巨大的推动作用。
【参考文献】
    [1] 盛树力.老年性痴呆发病机理研究进展和药物治疗未来战略[J].中国医学科学院学报,2004,26(2)：101－103.
    [2] Duff K. Alzheimer transgenic mouse models come of age[J]. TINS, 1997,20(7)：279－280.
    [3] Zhang YW, Xu H. Molecular and cellular mechanisms for Alzheimer’s disease：understanding APP metabolism[J]. Curr Mol Med,2007,7(7)：687－696.
    [4] Dewachter I, van Dorpe J, Spittaels K, et al. Modeling Alzheimer’s disease in transgenic mice：effect of age and of presenilin 1 on amyloid biochemistry and pathology APP/London mice[J]. Exp Gerontol,2000,35(627)：831－841.
    [5] Song SK, Kim JH, Lin SJ, et al. Diffusion tensor imagin detects age-dependent white matter changes in a transgenic mouse model with amyloid deposition[J]. Neurobi Dis,2004,15(3)：640.
    [6] 秦 川,常 洋,张兵林,等.老年性痴呆病转基因动物模型自发疾病病理学观察[J].中国实验动物学杂志,2001,11(1)：27－29.
    [7] 邓振明,袁应坚.中风痴呆病[J].中国医药学报,1991,6(3)：13.
    [8] 颜德馨,吕立言.老年性痴呆与瘀血的关系[J].辽宁中医杂志,1991,
18(8)：37－38.
    [9] 董桂英,赵世珂,郭立华.补肾活血法治疗老年期痴呆临床观察[J].中医药研究,1997,13(5)：13－14.
    [10] 李 浩,姚明江,赵文明,等.还脑益聪胶囊治疗老年轻度认知损害的双盲随机对照研究[J].中西医结合学报,2008,6(1)：25－31.
    [11] 张 兰,邢 颖,赵 玲,等.不同时程APP转基因小鼠学习记忆改变及参乌胶囊、二苯乙烯苷的干预作用[J].中国行为医学科学,2006,15(3)：193－196.
    [12] 邢 颖,张 兰,李 林.参乌胶囊抑制阿尔茨海默病模型小鼠脑内β-淀粉样肽生成的机制研究[J].中国老年学杂志,2006,26(7)：924－926.
    [13] 楚 晋,李 林,叶翠飞,等.淫羊藿黄酮对APP转基因小鼠学习记忆及β-amyloid生成的影响[J].中国科学技术大学学报,2008,38(4)：439－448.

基因敲除小鼠基因打靶的原则是，外源DNA 片段含有与目的基因的某一段核酸序列相同或接近的同源序列，同源重组就发生在这两个序列之间。基因敲除小鼠外源DNA 序列的定位整合有两种方式，即插入型(又称O 型) 和置换型(又称8 型)。与此相对应，打靶载体可分为两类：插入型载体和置换型载体。

基因敲除小鼠第一步，胚泡时期发育胚胎的分离。此胚胎来源于灰色品系的小鼠。

基因敲除小鼠第二步，从灰色小鼠胚泡中分离胚胎干细胞，在体外进行培养。

基因敲除小鼠第三步，用同源重组载体转染胚胎干细胞，用含有新霉素和更昔韦洛的培养基筛选发生了同源重组的细胞。

基因敲除小鼠第四步，将筛选得到的胚胎干细胞植入白色小鼠的早期胚胎（胚泡时期）中。

基因敲除小鼠第五步，将上述胚胎植入假孕母鼠（白色）子宫中。

基因敲除小鼠第六步，在母鼠所产的小鼠中，有一些是正常的白色，另一些则是嵌合体灰白相间的小鼠。这些嵌合体小鼠的细胞一部分起源于白色皮毛的胚泡细胞，另一部分则起源于重组的胚胎干细胞。起源于重组胚胎干细胞的皮毛显示出灰色斑块，很好辨认。

基因敲除小鼠第七步，嵌合体小鼠与野生型白色小鼠进行杂交，如果嵌合体小鼠的生殖细胞恰好是起源于重组胚胎干细胞，那么其子代小鼠就都应该呈现灰色。而这些灰色小鼠的所有细胞都是杂合体。

基因敲除小鼠第八步，杂合体灰色小鼠（+/H）之间进行杂交，得到灰色和白色的子代。从灰色子代中筛选出纯合小鼠（H/H），其一对同源染色体上的等位基因都失活，此纯合小鼠即为 “基因敲除小鼠构建”。